Andrea Colarusso,Concetta Lauro e Marzia Calvanese

Studio della proteina umana CDKL5 full-length e di sue varianti patologiche: valutazione dell’uso di piccole molecole per ripristinarne la funzione

La ConRett Onlus ha inteso finanziare il progetto di ricerca intitolato:

“Studio della proteina umana CDKL5 full-length e di sue varianti patologiche: valutazione dell’uso di piccole molecole per ripristinarne la funzione.”,

che sarà svolto presso i laboratori diretti dalla prof.ssa Maria Luisa Tutino al Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Napoli Federico II, ed avrà una durata di 12 mesi.

Buon lavoro alla prof.ssa Tutino ed ai suoi collaboratori.

 

Il disturbo da deficit di CDKL5 ( o “CDD”) è una malattia genetica grave e rara dovuta a mutazioni nel gene umano CDKL5, che dirige la sintesi di una proteina costituita da circa 1000 amminoacidi (definita CDKL5 full-length). CDKL5 è una proteina prodotta essenzialmente nei neuroni, nei quali si suppone che svolga numerosi ruoli,alcuni dei quali sono stati dimostrati, come la stabilizzazione delle sinapsi, la regolazione della polimerizzazione dei microtubuli, l’intervento nel riparo del DNA nucleare.Essendo una proteina chinasi, si suppone che abbia anche il ruolo di modulare la funzione di moltissime altre proteine, attraverso la sua capacità di trasferire specificamente ad esse un gruppo fosfato, un processo noto come fosforilazione. Ma l’identità di queste proteine e l’effetto della fosforilazione operata da CDKL5 sulla loro attività sono a tutt’oggi informazioni largamente ignote.

Ciò che sappiamo dallo studio delle mutazioni riscontrate nel gene CDKL5 dei pazienti affetti da CDD è che la malattia si manifesta tutte le volte in cui mutazioni, come quelle definite nonsense, frameshift o alcune delezioni, determinano la completa assenza dell’enzima dalle cellule. Altrettanto patologiche possono essere le mutazioni “missenso”, cioè dei cambiamenti della sequenza genica chedeterminano la sintesi di varianti di CDKL5 che differiscono dalla proteina sana per il cambiamento di un singolo amminoacido.

Uno degli obiettivi di questo progetto è capire come queste piccole differenze abbiano un impatto negativo sulla attività di CDKL5, interferendo con i suoi ruoli fisiologici nelle cellule neuronali. Ottenere queste informazioni èessenziale per capire le basi molecolari che determinano la malattia e per poter suggerire degli interventi terapeutici che possano contrastare gli effetti negativi delle sostituzioni amminoacidiche, consentendo alla proteina mutata il ripristino della sua normale o quasi normale attività.

In questo panorama, infatti, un approccio terapeutico molto interessante (e perseguito con successo in un’altra malattia genetica rara, la sindrome di Fabry) è rappresentato dal trattamento dei pazienti con chaperoni farmacologici. Si tratta di composti chimici che possono legare l’enzima mutato, e compensare in parte o del tutto la mutazione missenso, ripristinando la perfetta funzionalità enzimatica. Per la cura di questi malati, quindi, non è necessaria la somministrazione dell’enzima CDKL5 sano (obiettivo che si cerca di realizzare attraverso la terapia genica o la somministrazione della terapia proteica sostitutiva), ma basterebbe somministrare il composto chimico opportuno, in grado di compensare gli effetti negativi della mutazione singola.

Sebbene abbastanza semplice in linea di principio, questo approccio al trattamento della CDD non è mai stato suggerito prima perché richiede la disponibilità, sotto forma di enzima puro, dell’enzima CDKL5 sano e delle sue varianti missenso, che riproducono le mutazioni esatte trovate nei pazienti con CDD.

La produzione in laboratorio di CDKL5 è molto impegnativa per diversi motivi strutturali, ma recentemente il gruppo di ricerca della Prof. Tutino ha sfruttato una tecnologia innovativa (sviluppata per la prima volta a Napoli) per raggiungere questo obiettivo. Questo risultato consentirà per la prima volta al suo team multidisciplinare di descrivere meglio CDKL5 e di valutare la possibilità di ripristinare la corretta funzionalità di mutanti missenso di CDKL5 in seguito al loro legame con alcune molecole selezionate.

 

Obiettivi specifici e durata del progetto

Obiettivi del presente Progetto, della durata di un anno, sono:

  • produzione e purificazione della proteina CDKL5 full-length, in forma nativa ed in 10 varianti missenso selezionate tra quelle identificate in alcuni pazienti CDD;
  • produzione e purificazione dei soli domini catalitici oΔC hCDKL5, in forma nativa e nelle sue varianti missenso selezionate;
  • selezione di piccole molecole e studio della loro capacità di ripristinare la corretta funzionalità di alcune varianti missense patologiche di CDKL5.

 

Il gruppo di ricerca della Prof. Tutino è ospitato presso il Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Napoli Federico II, nel campus costituito da due dottori di ricerca (Concetta Lauro e Andrea Colarusso) e da due dottorande di ricerca (Marzia Calvanese e Angelica Severino). Un ulteriore contributo è fornito dalla Prof. Gilda Parrilli. Alcuni studenti del corso di Laurea magistrale in Biotecnologie molecolari ed industriali svolgono la loro tesi sperimentale su questa tematica.

Andrea Colarusso,Concetta Lauro e Marzia Calvanese

Andrea Colarusso,Concetta Lauro e Marzia Calvanese.